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| 發(fā)布時(shí)間： | 2025-04-30 14:28 |
| 最后更新： | 2025-04-30 14:28 |
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PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate）是一種廣泛用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的佛波酯（phorbol ester）類PKC激活劑。在使用PMA時(shí)，稀釋是一個(gè)非常重要的步驟，因?yàn)檎_的稀釋可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
稀釋步驟初始溶解：通常，PMA先用DMSO溶解成1 mg/mL的儲(chǔ)存液。這個(gè)濃度相對(duì)較高，便于后續(xù)的稀釋操作
分裝保存：將1 mg/mL的PMA儲(chǔ)存液分裝到EP管中，每管10 μL，保存在-20°C。這樣可以避免反復(fù)凍融對(duì)PMA活性的影響
工作濃度稀釋：在使用時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用PBS或其他適當(dāng)?shù)木彌_液將PMA稀釋到所需的工作濃度。例如，如果需要160 nmol/L的PMA，可以先計(jì)算出所需的稀釋倍數(shù)，進(jìn)行稀釋
稀釋倍數(shù)計(jì)算假設(shè)你有1 mg/mL的PMA儲(chǔ)存液，需要稀釋到160 nmol/L的工作濃度。需要將濃度單位統(tǒng)一：
1 mg/mL = 1000 μg/mL
PMA的分子量約為616.83 g/mol，1 μg PMA約為1.62 μmol（1/616.83）。
1 mg/mL的PMA儲(chǔ)存液相當(dāng)于1.62 mM（1.62 × 10^-3 M）。
要從1.62 mM稀釋到160 nmol/L（0.16 μM），稀釋倍數(shù)為：
[ \text{稀釋倍數(shù)} = \frac{1.62 \times 10^{-3} \text{ M}}{0.16 \times 10^{-6} \text{ M}} = 10125 ]
需要將PMA儲(chǔ)存液稀釋10125倍才能得到160 nmol/L的工作濃度。
稀釋誤差在稀釋過(guò)程中，隨著稀釋倍數(shù)的增加，誤差也會(huì)隨之增加。某些標(biāo)準(zhǔn)中會(huì)有逐級(jí)稀釋到多少濃度的規(guī)定，或者每次稀釋的倍數(shù)不能超過(guò)20倍的明確規(guī)定。為了減少誤差，可以采用逐級(jí)稀釋的方法，逐步達(dá)到所需的工作濃度。
應(yīng)用實(shí)例PMA常用于刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，通常與離子霉素（Ionomycin）聯(lián)合使用。在實(shí)驗(yàn)中，PMA的推薦使用濃度為0.1-10 μM。具體步驟如下：
試劑準(zhǔn)備：
Ionomycin：0.5 mg/mL用純乙醇配制，分裝保存。
PMA：0.1 mg/mL用DMSO配制，分裝保存。
細(xì)胞刺激：
收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用新鮮培養(yǎng)基重懸至細(xì)胞密度為1-2 × 10^6 cells/mL。
加入PMA（10 ng/mL）和Ionomycin（1 μg/mL），混勻后在37°C、5% CO2培養(yǎng)4-6小時(shí)。
細(xì)胞處理：
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇是否加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（如Monensin或Brefeldin A）。
離心收集細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞染色，檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)情況（如IFN-γ、IL-2、TNF-α等）。
通過(guò)以上步驟，可以確保PMA的稀釋效果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。